上海赛澜斯生物技术有限责任公司

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    赛先生

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    上海 闵行区

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    细胞库 / 细胞培养、技术服务、耗材

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细胞培养和传代操作步骤

24 人阅读发布时间:2024-02-29 13:21

1.运输方式
1.1干冰运输
收到细胞后需立即转入液氮保存、或者-80°C冰箱短期冻存、或者直接复苏。
1.2常温运输
收到细胞后,请立即将细胞培养瓶从包装盒中取出,并按照下方操作步骤进行培养传代。

2.细胞培养操作步骤
2.1细胞培养瓶
对于贴壁培养的细胞,寄送前,我们会将培养基充满整个培养瓶,以减少产品运输过程中贴壁细胞的脱落。收到细胞后,请注意观察是否有污染。将培养瓶置于倒置显微镜下仔细检查是否浑浊、是否细菌污染。因为运输过程中存在颠簸,且有些细胞对温度变化也很敏感,可能存在一些细胞脱落漂浮的情况,这些细胞仍是活细胞,请勿丢弃,可离心富集后传代使用。
1)贴壁细胞,在生物安全柜环境中,用真空泵去除培养瓶中多余的培养基,至剩余5-8mL 左右,随后根据培养基选择合适的CO2含量的37℃恒温培养箱中培养,拧松瓶盖。如果细胞已经长满培养瓶,请立即传代;
2)悬浮的细胞,在生物安全柜环境中,转移培养瓶中的细胞至离心管,150 g 离心 5 分钟,去除上清后,用5 mL培养基吹散细胞,转移至新的培养瓶中,随后置于合适的CO2含量的37℃恒温培养箱中培养。
2.2冻存管
注意:为保证细胞的高活率,请收到产品后,立即解冻培养,参考以下步骤:
1)将冻存管置于37℃水浴中来回晃动,迅速解冻。为避免污染,确保冻存管口置于水面之上。解冻需迅速,大约1分钟;
2)一旦冻存管中液体融化后,立即取出,采用酒精喷拭冻存管表面。从此步开始,后续操作须在生物安全柜中完成;
3)将冻存管中的液体转移到含有5mL完全培养基的离心管中,150 g 离心 5 分钟,用真空泵去除上清;
4)用完全培养基重新悬浮细胞并转移到新的培养瓶中。为保证细胞复苏的存活率,请将培养基在37℃水浴预热后使用;
5)将细胞置于含有合适CO2的37℃恒温培养箱中培养。

3.传代培养
细胞密度达80% - 90%,即可进行传代培养。
3.1贴壁细胞
1)吸取并弃掉培养瓶中培养基,加入PBS润洗一次;
2)加入1 mL 0.25 (w/v) Trypsin-EDTA 溶液,并置于37℃培养箱中孵育,直至细胞从壁上脱落分离。此过程大约需要3-5分钟;
3)加入2mL完全培养基中和胰蛋白酶,并轻轻吹打将细胞从培养瓶表面吹落,并使细胞分散;
4)将细胞悬液收集到15mL离心管里,150 g 离心 5 分钟,用真空泵去除上清。取适量的培养基将细胞重悬,转移到新的培养瓶中培养。
3.2    悬浮细胞
3.2.1直接传代法
1)待悬浮细胞长满至 80%~90%(细胞悬液变黄),即可传代;
2)用吸管吸弃细胞悬液 1 / 2~1 / 3;
3)加入适量的新鲜培养基,继续培养。
3.2.2离心传代法(在发现有细胞碎片的情况下)
1)将细胞悬液转移到离心管内;
2)150 g 离心 5 min,弃去上层清液;
3)使用新鲜的培养基重悬细胞;
4)吸管吸取适量细胞悬液,装入新的培养瓶,再加入适量的新鲜培养基,继续培养。

4.    细胞冻存操作
1)1000 rpm离心5分钟去掉上清。加1 mL血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和DMSO,轻轻混匀,    DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1 x 106/mL,每支冻存管冻存1mL细胞悬液,注意冻存管做好标识;
2)将冻存管置于程序降温盒中,放入-80°C冰箱,至少2个小时以后转入液氮灌储存。
资料格式:

细胞培养和传代操作步骤.pdf

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